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翻译组技术到底是什么?为什么能发高分文章?

浏览量:19 次 发布时间:2019-03-26 15:32 编辑: 来源:

为什么是翻译组


如上篇所讲,翻译调控是独立于转录调控的一个重要过程。那么,为了研究基因终产物,蛋白质谱也是不错的技术。但蛋白质谱技术有两个缺点和一点不足:


缺点1:蛋白质谱检测敏感性,低丰度蛋白难以检测。


以人类为例,大部分转录组可以检测到15,000以上的基因表达。但如果是蛋白质谱,检测五六千个基因算很不错了。并非表达成蛋白的基因只有这么多,而是质谱仪达不到测序仪的检测敏感性。


缺点2:蛋白质谱检测技术定量不准


相比测序技术,蛋白质谱的定量精度相对比较差,只能体现上升或下降的趋势,更具体的倍数关系实际上不准确。


不足:质谱检测到蛋白是存量,而不是瞬间合成量。


蛋白是半衰期相对比较长的物质,细胞中实时的蛋白含量,应该是蛋白合成与蛋白降解动态平衡的产物。


在一个迅速调控变化的系统里面,例如细胞突然遭遇热胁迫,翻译速率是转瞬变化的。而且,为了提高应答的速率,往往是转录不变的情况下(因为转录在中心法则前半部,应答链太长,不利于迅速响应胁迫),翻译被进行剧烈地调控(以秒来计算)。


这个时候,蛋白质长达几十个小时的半衰期,就成为了蛋白质谱检测这种瞬间翻译变化的短板。这个时刻,蛋白质谱检测的是存量,而不是蛋白瞬间合成量。尤其是做转录组-蛋白关联分析的老师来说,这个时候蛋白质谱的结果,可能有一定的误导性——蛋白合成速率已经变了,但蛋白质谱结果没有体现。


所以,在某些研究中,我们需要一种可以融合转录组与蛋白质谱的优点,且可以作为转录组与蛋白质谱研究的桥梁,将两个组学的关系串联在一起的技术。


这个技术就是翻译组。翻译组的优点如图1。因为它本身是一种测序技术,所以有转录组的优点。其次,它检测的是正在翻译的RNA,所以与蛋白质谱又有很强关联性,所以成了组学研究非常重要的组成部分。


图1 翻译组融合了其他两种组学技术的优点

与翻译组相关的两个不同技术的比较


广义的翻译组(Translatome)测序包括两大类:多聚核糖体测序(polyribosomeprofiling)和核糖体足迹测序(Ribosome footprints profiling)。虽然可以统称为翻译组,但这两类测序方法本质是实验方法的不同,对应的两种方法所得到的数据的功能也不同。


在讲翻译组的方法前,我们先要了解蔗糖密度梯度离心法。该方法的基本原理是:当我们向一个离心管中加入不同浓度(例如5%和20%)的蔗糖溶液。在短时间内,两个溶液层不会互溶,而是由于密度不同,而呈现分层。


当向这个分层的离心管中加入分子样本,并进行超速离心后,不但不同密度(浓度)的蔗糖溶液会呈现分层,而且样本中不同分子量的物质也将悬浮在不同密度的蔗糖溶液中。通过分取特定浓度的蔗糖溶液层,就可以富集悬浮在其中的特定分子量的物质。


图2 蔗糖密度梯度离心法


多聚核糖体测序(polyribosome profiling),在某些文献里面,又被称为核糖体新生肽链复合物结合的mRNA测序(ribosomenascent-chain complex-bound mRNAs sequencing),简称RNC-seq,通常是直接通过蔗糖密度梯度超速离心的方法,将与多个核糖体结合的全长mRNA进行富集并测序。

该方法的基本原理是:由于正在翻译的mRNA与核糖体(核糖体是个很“沉”的细胞器,黏上mRNA后,mRNA也是“沉甸甸的“)结合形成复合物后,分子量会提高。且单条mRNA结合的核糖体越多,复合物的分子量越大。


通常1条mRNA模版可以同时结合多个核糖体,从而并行合成多个蛋白分子,因此正在翻译的mRNA分子会与多个核糖体形成多聚核糖体复合物(Polysomes),通常会悬浮在高密度的蔗糖溶液层中(见下图)。从高密度的蔗糖溶液层中,就自然可以分离正在翻译的mRNA分子。


因此,多聚核糖体测序富集的步,是得到全长的与核糖体结合的正在翻译的mRNA分子。后续的实验步骤则与RNA-seq完全相同,结果与RNA-seq也极为相似。


图3 蔗糖密度梯度离心分离多聚核糖体复合物示意图。X轴对应蔗糖溶液的不同浓度层,Y轴是对应浓度层的吸光度(就是悬浮期间的物质量)


核糖体足迹测序(Ribosomefootprints profiling),简称Ribo-seq,其实验步骤如图4。相比RNC-seq,核糖体足迹测序最大的区别是加入了核酸酶消化这个步骤。


在酶切这个步骤,会导致没有被核糖体大小亚基保护的mRNA片段被降解,而保留下的mRNA片段(平均长度约为28nt左右)才是真正的正在被核糖体结合,正在翻译的mRNA片段。


这些被核糖体结合的mRNA片段,看起来像核糖体在翻译的瞬间在mRNA上留下的足迹,所以这些mRNA片段又被称为核糖体足迹(Ribosomefootprints,简称RFs),这就是核糖体足迹测序这个名称的由来。


图4 核糖体足迹测序(Ribosomeprofiling)的实验步骤


核糖体足迹(RFs)检测翻译进行程度的精度,是单密码子级别的。大部分生物核糖体保护的mRNA片段长度约为28nt左右(但不同物种,不同组织有一定变异范围),即RFs的理论长度为28nt。


从这个信息就可以获得核糖体内部翻译的全部信息。以核糖体中肽链合成延伸的关键位点P位点(peptidyl-tRNAsite,即瞬间肽酰-tRNA复合物的结合密码子的位置)为例。


与P位点结合的密码子就是对应正在合成的肽段氨基酸序列,这个位置位于整个RFs第13~15个碱基的位置。因此,我们只要获得RFs信息,就可以获得对应的mRNA序列翻译的丰富信息,包括:


(1)序列中的哪些位置可以被翻译。

(2)一段序列理论上不止一个开放阅读,到底哪个才是真实的被翻译的开放阅读。

(3)核糖体翻译进行到哪个位置了。

(4)翻译起始、延伸、终止不同阶段的速率变化,以及翻译在某个阶段是否终止了。

… …


图5 核糖体足迹的特点


当然,蔗糖密度梯度离心操作过于复杂,所以的不少研究人员试图简化这些实验方法。在Ribo-seq方面,研究人员发现使用单一浓度(1M浓度,即34%浓度)的蔗糖缓冲液就已经可以很好地将酶切后的RNC-RNA复合物富集下来,从而替代原来复杂的蔗糖密度梯度离心法 [1]。


这个思路也被推广到了RNC-seq里面。人们一度认为活跃翻译的mRNA通常结合着多个核糖体进行翻译,而非活跃的mRNA结合的核糖体很少。然而近年来的研究表明,即便只结合了单个的核糖体,翻译也照样可能是活跃的。


例如,在公认翻译非常活跃的处于富营养培养基上对数生长的大肠杆菌或者人细胞系HEK293中,其单核糖体组分(原核为70S,真核为80S)都占主要地位[2,3]。将单核糖体组分分离出来后置入无细胞翻译系统中,其核糖体可以继续翻译过程生成蛋白质[4] 。


这些都证明翻译的活跃程度与mRNA上核糖体的数量并无关系。基于这样的考量,国内研究翻译组的大牛暨南大学的张弓教授在后续研究RNC-seq的时候,也使用单一1M浓度的蔗糖缓冲液替代密度离心法,同样取得了非常好的效果[5]。

图6 在大肠杆菌[2]和HEK293[3]细胞中,单核糖体都占了很大的权重

方法区别的小结

图7 RNA-seq、RNC-seq和Ribo-seq的比较(PLoS genetics, 2016, 12(2): e1005901)


如图7,我们可以直观比较mRNA-seq、RNC-seq和Ribo-seq实验的区别。其中,mRNA-seq和RNC-seq最为相似,都是测mRNA序列全长。不同的是,RNC-seq测的是与核糖体结合的正在翻译的mRNA的全长。


但美中不足的是,RNC-seq精度是mRNA全长序列级别的,对于mRNA内部的翻译信息,我们则是无法获知的。而Ribo-seq则是弥补了这个不足。由于Ribo-seq的精度是单密码子级别的,因此Ribo-seq不仅可以获得整个基因翻译量的信息,可以从中进一步获知基因内部翻译变化的丰富信息。Ribo-seq相比RNC-seq的优势,如下表。

 

表1RNC-seq和Ribo-seq的比较


要获得Ribo-seq的这些优势,代价是实验难度被大大提高了。但这些优势在具体的研究中,还是非常有价值的。在omicshare课堂《热点研究——翻译组介绍与应用》(点击文章底部 阅读原文 或直接复制下方链接观看课程)里,我们提到基于Ribo-seq可以进行三大分析(如图8)。


课程链接:

http://www.omicshare.com/class/home/index/series?id=39


其中,“新可翻译分子”和“翻译调控”这两个分析点,就是建立在Robi-seq单密码子精度的基础上,这是RNC-seq所无法达到的。当然,RNC-seq也有实验相对简单,使用物种广的优点。对于难以开展Ribo-seq的物种,采用RNC-seq的策略,进行翻译定量也是不错的选择。


图8 Ribo-seq的三大分析点

那么,Ribo-seq的三大分析点在实际研究中都有什么作用? Omicshare Class在线课堂《热点研究——翻译组介绍与应用》(点击文章底部 阅读原文 观看课程)。在这一系列课堂的第二集,我们透过逆境胁迫、发育衰老和肿瘤发生发展这3个不同研究领域的实例,来为您解析翻译组高分文章的几种常见套路。

参考文献:

[1] Ingolia N T, Brar G A, et al. The ribosome profiling strategyfor monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protectedmRNA fragments[J].

[2] Zhong J, Xiao C, et al. Transfer RNAs mediate the rapidadaptation of Escherichia coli to oxidative stress[J]. PLoS genetics, 2015,11(6): e1005302.

[3] Morello L G, Hesling C, Coltri P P, et al.The NIP7 protein is required for accurate pre-rRNA processing in humancells[J]. Nucleic acids research, 2010, 39(2): 648-665.

[4] Zhang G, Hubalewska M, Ignatova Z.Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis andco-translational folding[J]. Nature structural & molecular biology, 2009,16(3): 274.

[5] Wang T, Cui Y, Jin J, et al. TranslatingmRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and theirtranslation ratios are phenotype specific[J]. Nucleic acids research, 2013,41(9): 4743-4754.


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本文永久链接:http://www.mecsb.com/catalog-show-685741.shtml
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